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本發(fā)明公開了一種核定位蛋白 1(Nulp1)在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用 領(lǐng)域。本發(fā)明確定了 Nulp1 的表達(dá)與心肌肥厚之間的相互關(guān)系，研究結(jié)果表明在發(fā)生心肌肥厚的模型中， Nulp1 的表達(dá)和正常組相比顯著降低;抑制 Nulp1 表達(dá)顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能，促 進(jìn) Nulp1 過(guò)表達(dá)則顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護(hù)心功能。因此，Nulp1 可作為靶基因，用于篩選 保護(hù)心臟功能、抗心臟纖維化和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，用于制備保護(hù)心臟功能、抗 心肌肥厚和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，為心肌肥厚的治療提供了一條有效的新途徑。

本發(fā)明涉及一種絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合膜的快速成型方法，目前還沒有一種制備條件溫和，生產(chǎn)過(guò)程綠色環(huán)保的絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合膜的成型方法。本發(fā)明將絲膠蛋白溶液干燥得絲膠蛋白膜；該膜浸入體積濃度35-45%乙醇溶液中，7-15min后取出得乙醇處理絲膠蛋白膜；將乙醇處理絲膠蛋白膜置于濃度為100mmol/L的CaCl2溶液中浸漬處理5-20s得浸漬處理絲膠蛋白膜，再置于濃度為60mmol/L的Na2HPO4溶液中浸漬處理5-20s得一次交互浸漬處理絲膠/羥基磷灰石復(fù)合膜，再重復(fù)用CaCl2溶液和Na2HPO4溶液浸漬處理得絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合膜。本發(fā)明制備條件溫和，生產(chǎn)周期短和綠色環(huán)保。

01.成果簡(jiǎn)介   “相”是指物質(zhì)系統(tǒng)中物理、化學(xué)性質(zhì)完全相同，與其他部分具有明顯分界面的均勻部分。“相變”是指物質(zhì)從一種相轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N相的過(guò)程。與固、液、氣三態(tài)對(duì)應(yīng)，物質(zhì)有固相、液相、氣相。有研究表明，相變機(jī)制也廣泛存在于生物細(xì)胞中，且在細(xì)胞生命周期的時(shí)空調(diào)控等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。當(dāng)溶液中的多價(jià)大分子與其多價(jià)配體互作時(shí)，容易產(chǎn)生更大的復(fù)合物，后者的溶解度一般會(huì)降低，從而從普通溶液相分離出來(lái)，形成一個(gè)復(fù)合物富集的獨(dú)立的液態(tài)相，這個(gè)轉(zhuǎn)變過(guò)程被稱為“液-液分離相變”（即，“相變”）。 蛋白質(zhì)翻譯后修飾是指蛋白質(zhì)翻譯完成后，發(fā)生在蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基上的共價(jià)修飾過(guò)程，是蛋白質(zhì)生物合成的步驟之一。目前，已知存在300多種翻譯后修飾，常見的有甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化修飾等，與蛋白質(zhì)翻譯后修飾相反的修飾過(guò)程為蛋白質(zhì)去修飾，如去甲基化、去乙酰化、去磷酸化、去泛素化、去糖基化等。 本項(xiàng)成果是一種檢測(cè)翻譯后/復(fù)制后/轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白質(zhì)/DNA/RNA與其修飾閱讀器間相互作用的成套試劑，由A、B、C和D四種試劑組成；（1）A由名稱為R的生物分子和名稱為X的蛋白質(zhì)連接而成；（2）B含有名稱為L(zhǎng)的生物分子；R與L相同或不同且二者間具有相互作用，R與L相互作用后發(fā)生相變；（3）C為由C單體形成的多聚體，C單體由名稱為mc的單體、名稱為甲的報(bào)告基團(tuán)和名稱為YC的生物分子連接得到的分子，大于等于兩個(gè)的mc能形成多聚體；（4）D由名稱為XL的帶有修飾的蛋白質(zhì)和名稱為YD的生物分子連接而成；YC與YD間具有相互作用。通過(guò)該成套試劑及基于該成套試劑創(chuàng)建的多價(jià)招募系統(tǒng)，利用相變機(jī)制實(shí)現(xiàn)了互作蛋白和配體在相變液滴中的高度富集，將原本較弱的互作信號(hào)強(qiáng)烈放大，使其易于檢測(cè)。02.應(yīng)用前景 本項(xiàng)成果可以為檢測(cè)經(jīng)翻譯后/復(fù)制后/轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白質(zhì)/DNA/RNA與其修飾閱讀器間的相互作用提供一種全新的技術(shù)手段。該技術(shù)尤其適合高通量篩選修飾酶或去修飾酶的抑制劑或促進(jìn)劑。03.知識(shí)產(chǎn)權(quán) 本項(xiàng)成果已申請(qǐng)1項(xiàng)發(fā)明專利。04. 團(tuán)隊(duì)介紹 本項(xiàng)成果負(fù)責(zé)人為清華大學(xué)研究員、博士生導(dǎo)師、清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心成員、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心成員、中組部“青千”基金獲得者，主要從事“相變”相關(guān)領(lǐng)域的研究，并探索能夠廣泛應(yīng)用于鑒定生物大分子互作及互作調(diào)控物篩選的新技術(shù)。研究成果發(fā)表于多個(gè)國(guó)際頂級(jí)權(quán)威期刊，申請(qǐng)專利多項(xiàng)。05.合作方式 專利許可、合作開發(fā)。06.聯(lián)系方式 [email protected]

【發(fā) 明 人】樊文玲；肖偉；郭峰；潘林梅；朱運(yùn) 【摘要】 堿性中藥活性蛋白類成分吸附后膜的吸附和解吸裝置及吸附和解吸方法。該裝置由膜組件、循環(huán)泵、提取液或解吸液雙層儲(chǔ)料槽、滲透液儲(chǔ)料槽、壓力表、流量計(jì)、恒溫水浴、蠕動(dòng)泵、不銹鋼管道制成。該方法為：在0.25MPa下恒溫，膜超濾吸附含量為98%的堿性中藥活性蛋白類提取物溶液24h，計(jì)算活性成分吸附量，將吸附后的膜裝在解吸裝置上，將pH為5的鹽酸溶液作為解吸劑，恒溫，在壓力小于0.05MPa和膜面流速在0.1-1m/s條件下進(jìn)行解吸，得解吸率95%-99%。該方法和裝置適用于堿性中藥蛋白類成分的膜精制過(guò)程，尤其是注射劑除熱原和樹脂過(guò)程，可大大降低該類活性成分的損失率，提高其轉(zhuǎn)移率，同時(shí)膜獲得較好的再生。

血管活性腸肽(vasoactiveintestinalpeptide，VIP)是一種由 28 個(gè)氨基酸組成的多肽，主要是由外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，由副交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放，并且與乙酰膽堿共同存在，被認(rèn)為是胰高血糖素-胰泌素家族的一員。廣泛分布在中央神經(jīng)系統(tǒng)的類膽堿突觸前神經(jīng)細(xì)胞和外周肽能神經(jīng)細(xì)胞中，通過(guò)它可對(duì)多種器官進(jìn)行神經(jīng)支配，比如心臟，肺，消化系統(tǒng)和泌尿生殖道，眼睛，皮膚，卵巢和甲狀腺。VIP 在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中是一種重要的信號(hào)肽，通過(guò)其受體發(fā)揮生理作用，迄今為止，已有 3 種類型的 V

積極地從血液中去除β2-MG可以有效地預(yù)防和治療DRA。 一、項(xiàng)目分類 關(guān)鍵核心技術(shù)突破 二、成果簡(jiǎn)介 β2微球蛋白(β2-Microglobulin，β2-MG)是由淋巴細(xì)胞、血小板、多形核白細(xì)胞產(chǎn)生的一種小分子球蛋白，是主要組織相容性復(fù)合物(MHC-Ⅰ )的輕鏈部分，由99個(gè)氨基酸組成，分子量為11.8KD，半徑1 .6nm，可以從腎小球自由濾過(guò)，99.9％在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細(xì)胞中分解破壞。正常人血清中β2-MG的含量是0 .5～3mg/L。長(zhǎng)期接受透析治療的腎損傷患者體內(nèi)β2-MG容易產(chǎn)生積聚，從而引發(fā)透析相關(guān)性淀粉樣病變(DialysisRelated Amyloidosis，DRA)。病理?xiàng)l件下，腎損傷患者血液中的β2-MG的含量是正常水平的50-60倍，約為84mg ,主要癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織淀粉樣蛋白的沉積，從而導(dǎo)致骨骼和關(guān)節(jié)的病原性病變。透析多年的腎病患者，DRA臨床癥狀包括腕管綜合征(CTS)、骨關(guān)節(jié)病、破壞性關(guān)節(jié)病、囊性骨病和病理骨折。血液透析治療15年以上的患者，將出現(xiàn)系統(tǒng)性淀粉樣病變。因此，積極地從血液中去除β2-MG被認(rèn)為是有效地預(yù)防和治療DRA。

高效脂肪酶催化制備脂溶性維生素關(guān)鍵技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化

1、成果來(lái)源、成果被評(píng)價(jià)及認(rèn)定（發(fā)明專利授權(quán)號(hào)）等情況 本項(xiàng)目來(lái)源于國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“大宗糧食綠色加工技術(shù)與 產(chǎn)品”中課題“玉米淀粉加工關(guān)鍵技術(shù)研究與示范（2012BAD34B07，479 萬(wàn)元， 研究起止時(shí)間：2012.01-2014.12）”和國(guó)家自然科學(xué)基金“酶法選擇性合成單一 類型環(huán)糊精的控制策略研究（31101228，25 萬(wàn)元，研究起止時(shí)間：2012.01- 2014.12）”，屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本項(xiàng)目累計(jì)申請(qǐng)發(fā)明專利 7 項(xiàng)（1 項(xiàng)獲授權(quán)），發(fā)表論文 11 篇（8 篇被 SCI 收錄），于 2015 年 7 月通過(guò)中國(guó)糧油學(xué) 會(huì)鑒定，獲國(guó)際先進(jìn)評(píng)價(jià)。 2、主要技術(shù)內(nèi)容、作用、對(duì)行業(yè)的意義，獲獎(jiǎng)情況 CGT 酶生產(chǎn)環(huán)糊精最不利的條件之一是產(chǎn)物特異性差，給產(chǎn)物的分離純化 帶來(lái)很大不便。同時(shí)，CGT 酶存在的另一大缺陷是其熱穩(wěn)定性較差，由于在環(huán)糊 精工業(yè)化生產(chǎn)中，底物淀粉首先要經(jīng)過(guò)高溫糊化、液化處理，然后降溫至適當(dāng)溫 度進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，若 CGT 酶能夠適應(yīng)更高的反應(yīng)溫度，勢(shì)必有助于提高反應(yīng)效率， 因此，有必要改善 CGT 酶的熱穩(wěn)定性，提高其催化效率，進(jìn)而有效降低環(huán)糊精生20 產(chǎn)成本。本項(xiàng)目主要是通過(guò)改善 CGT 酶產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性，提高該酶的使用 性能，將其應(yīng)用于環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)中，能顯著降低環(huán)糊精的生產(chǎn)成本，促進(jìn) 環(huán)糊精在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用 越來(lái)越廣闊，開發(fā)改善 CGT 酶使用性能的關(guān)鍵技術(shù)顯得尤為重要，具有很好的推 廣應(yīng)用前景。 3、成果的技術(shù)指標(biāo)、創(chuàng)新性與先進(jìn)性 本項(xiàng)目在長(zhǎng)期從事淀粉生物轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程 中 CGT 酶的產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性較差問(wèn)題，通過(guò)深入研究和不懈努力，逐步改 善了 CGT 酶的產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性，突破了關(guān)鍵技術(shù)，并實(shí)現(xiàn)了具有理想產(chǎn)物 特異性和熱穩(wěn)定性的β-CGT 酶突變體在酶法生產(chǎn)β-環(huán)糊精中的應(yīng)用。該酶使用 性能改善易操作，具有很好的應(yīng)用價(jià)值，技術(shù)位于國(guó)際領(lǐng)先水平。與國(guó)內(nèi)外同類 技術(shù)相比，具有以下創(chuàng)新： ①針對(duì) CGT 酶產(chǎn)物特異性較差的問(wèn)題，確定了 CGT 酶的產(chǎn)物特異性與其一級(jí) 結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，獲得構(gòu)建具有理想產(chǎn)物特異性的 CGT 酶突變體的簡(jiǎn)單可行方法， 為從本質(zhì)上改善 CGT 酶的產(chǎn)物特異性提供理論基礎(chǔ)； ②針對(duì) CGT 酶熱穩(wěn)定性較差的問(wèn)題，采用定點(diǎn)突變技術(shù)闡明了重要氨基酸殘 基對(duì) CGT 酶熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的規(guī)律，獲得了構(gòu)建具有理想熱穩(wěn)定性的 CGT 酶突 變體的簡(jiǎn)單可行方法，為從根本上改善 CGT 酶的熱穩(wěn)定性打下了基礎(chǔ)； ③ CGT 酶使用性能的改善方法簡(jiǎn)單易行，所得到具有理想產(chǎn)物特異性和熱 穩(wěn)定性的酶突變體可直接應(yīng)用于β-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)，能提高β-環(huán)糊精的得 率，降低β-環(huán)糊精的生產(chǎn)成本。 

隨著首個(gè)RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發(fā)現(xiàn)，RNA表觀遺傳學(xué)/表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)開始興起并成為表觀遺傳學(xué)新的研究熱點(diǎn)。m6A作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結(jié)合蛋白發(fā)揮調(diào)控功能。已發(fā)現(xiàn)m6A具有調(diào)控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細(xì)胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過(guò)程的功能調(diào)控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m6A高通量測(cè)序技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。 現(xiàn)有m6A測(cè)序技術(shù)主要依賴于m6A抗體富集技術(shù)，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯(lián)用iCLIP或PAR-CLIP技術(shù)的高分辨率m6A測(cè)序技術(shù)miCLIP 或PA-m6A-seq。抗體存在對(duì)特定RNA序列或結(jié)構(gòu)的潛在非特異性結(jié)合，為了解決抗體方法的種種問(wèn)題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發(fā)了兩類無(wú)需抗體的m6A測(cè)序技術(shù)，一類為利用對(duì)特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸內(nèi)切酶MazF輔助的測(cè)序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法只能檢測(cè)16~25%的m6A位點(diǎn)；另一種是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實(shí)現(xiàn)的m6A測(cè)序（DART-seq），但該方法依賴于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率且受限于體外樣品的使用。 賈桂芳課題組一直致力于開發(fā)和利用核酸化學(xué)生物學(xué)技術(shù)研究RNA化學(xué)修飾在動(dòng)植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學(xué)惰性的m6A轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)活性的中間態(tài)產(chǎn)物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發(fā)生亞胺1,2加成反應(yīng)，將不穩(wěn)定的hm6A轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的巰基加成產(chǎn)物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在mRNA上m6A的位置標(biāo)記生物素Biotin，最終可被鏈霉親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供后續(xù)高通量測(cè)序使用。

本項(xiàng)目涉及一種新型的超級(jí)糖胺聚糖裂解酶 HCLase. 通過(guò)對(duì)提取的外周血基因組 DNA 與目的基因 GSTM3 啟動(dòng)子的甲基化特異 性引物對(duì)和探針、內(nèi)參基因 ALU-C4 的特異性引物對(duì)和 Taqman 熒光探針序列， 對(duì)處理過(guò)的 DNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)剑≒CR）反應(yīng),用甲基化特異性 PCR 205 的方法檢測(cè)目的基因 GSTM3 和內(nèi)參基因 ALU-C4 的閾值循環(huán)值，并計(jì)算出基 因 GSTM3 甲基化定量值。有助于評(píng)估病情、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療。