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谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)被廣泛用于食品工業(yè)生產(chǎn)，是一種安全性很高的工業(yè)菌株；具有包括 Sec 和 Tat 分泌途徑在內(nèi)完善的蛋白分泌系統(tǒng)；沒有類似于大腸桿菌(E. coli)所帶來的內(nèi)毒素和宿主細(xì)胞蛋白污染等問題。這些顯著優(yōu)點(diǎn)使它成為一種有吸引力的外源蛋白表達(dá)生產(chǎn)用的底盤細(xì)胞。目前國內(nèi)生物醫(yī)藥領(lǐng)域主要依賴于 E.coli 表達(dá)體系生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白，原創(chuàng)性外源蛋白表達(dá)體系的缺失，在知識產(chǎn)權(quán)方面將制約到我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該項(xiàng)成果有望為我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)提供一個具有自主知識 產(chǎn)權(quán)的谷氨酸棒桿菌安全高效外源蛋白表達(dá)體系。

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是谷氨酸單體以γ-羧基與氨基相縮合的一種聚氨基酸，γ-PGA主鏈上有大量游離羧基存在，使聚谷氨酸具有水溶性聚羧酸的性質(zhì)，如強(qiáng)吸水保濕性能，可用于化妝品、食品、分散劑、螯合劑、建筑涂料、防塵等領(lǐng)域，主鏈上的大量羧基易于修飾，為材料的功能化提供了條件，利于改性制備一系列功能材料。γ-PGA同時亦具有優(yōu)良的生物可降解性和生物相容性，對環(huán)境無污染，對人體無毒害，用作醫(yī)藥、生物醫(yī)用材料、化妝品、食品和環(huán)保等領(lǐng)域有明顯優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室篩選得到一株γ-PGA高產(chǎn)菌株（已獲專利授權(quán)：γ-聚谷氨酸及其鹽的制備方法，CN0112787.2），并對合成工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化；采用提純新工藝，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。同時，還開展了γ-PGA吸水材料的制備、綠色水處理劑、肥料增效等領(lǐng)域的應(yīng)用研究。本項(xiàng)目已申請4項(xiàng)國家發(fā)明專利。

本項(xiàng)目由細(xì)消型連續(xù)等電結(jié)晶、基于熱變性的菌體絮凝及谷氨酸二次蒸發(fā)結(jié)晶等關(guān)鍵技術(shù)組成，經(jīng)過技術(shù)與裝備集成，形成了完整的“谷氨酸雙結(jié)晶綠色制造”技術(shù)。（1）谷氨酸提取收率≥94.0%，產(chǎn)品純度≥98.0%；（2）硫酸消耗降低54%，液氨消耗降低 100%；（3）菌體蛋白去除率從 80%提高到 99%以上；（4）生產(chǎn)性高濃度廢水減少 90%以上，無中低濃度廢水。 創(chuàng)新要點(diǎn) 從谷氨酸生產(chǎn)全局出發(fā)，綜合考慮原輔材料消耗、產(chǎn)品收率與質(zhì)量、環(huán)境污染治理及廢棄物綜合利用等因素對生產(chǎn)成本的影響，從而形成整體最優(yōu)的谷氨酸生產(chǎn)技術(shù)。 

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng) 域。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸 非依賴型 γ-PGA 合成菌。為了提高其 γ-PGA 產(chǎn)量，項(xiàng)目組采用無痕 基因編輯技術(shù)對菌株進(jìn)行了代謝工程改造。包括三部分：模塊化代謝 通路改造；蔗糖代謝途徑改造；谷氨酸合成途徑改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是項(xiàng)目組從發(fā)酵食品中分離得到，它能 夠從蔗糖出發(fā)合成 γ-PGA。利用模塊化通路改造策略對 γ-PGA 合成 相關(guān)的八個代謝通路進(jìn)行改造包括：γ-PGA 降解相關(guān)途徑；細(xì)胞呼吸 鏈；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途徑；細(xì)菌多糖合成途徑；次級小分 子代謝產(chǎn)物合成途徑；細(xì)胞自誘導(dǎo)因子合成途徑；谷氨酸合成途徑以 及 γ-PGA 合成途徑。最終整合獲得的最優(yōu)基因工程菌株 NK-anti-rocG （敲除了 epsA-O 操縱子（負(fù)責(zé)胞外多糖合成），sac 操縱子（負(fù)責(zé)果 聚糖合成），lps（脂多糖合成相關(guān)），pta（乙酸合成相關(guān)），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（細(xì)胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表達(dá) anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脫氫酶表達(dá)））γ-PGA 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量從 3.8 g/L 提高到 11.04 g/L，較對照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 產(chǎn)物純度也 從 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)得到 NK-anti-rocG 菌株產(chǎn)量可達(dá) 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，純度 95%以上。 項(xiàng)目特色： 1. 菌種（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依賴型 γ-聚谷 氨酸合成菌株；發(fā)酵生產(chǎn)主要原料為蔗糖； 2. 補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量為：20.3 g/L。 3. 授權(quán)專利號為：ZL200810053900.7 市場應(yīng)用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng) 域。本項(xiàng)目采用谷氨酸非依賴型 γ-聚谷氨酸合成菌做為發(fā)酵菌種，以 蔗糖為原料發(fā)酵法生產(chǎn) γ-聚谷氨酸，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效 益。

成果簡介： L-賴氨酸L-谷氨酸鹽作為一種氨基酸復(fù)合鹽，與氨基酸衍生物不同，它同時具有兩種氨基酸的生物作用，甚至相互增強(qiáng)對方的生物作用，又比單體氨基酸的理化性質(zhì)更優(yōu)越，可以更好的應(yīng)用在醫(yī)藥、食品和化妝品等方面。L-賴氨酸L-谷氨酸鹽可

主要由 D-谷氨酸和 L-谷氨酸通過酰胺鍵聚合而成。作為一種高分子聚合物，γ-聚谷氨酸具有一些獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性如良好的水溶性，超強(qiáng)的吸附性，能徹底被生物降解，無毒無害，可食用等。在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品，環(huán)保，合成纖維和涂膜等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因此極具開發(fā)價值。 微生物絮凝劑是繼無機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑之后出現(xiàn)的一種新型的、可自然降解的水處理劑，具有高效、無毒、無二次污染的特點(diǎn)。微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外具有絮凝活性的代謝產(chǎn)物，一般由多糖、蛋白質(zhì)、DNA、纖維素、糖蛋白、聚氨基酸等高分子物質(zhì)構(gòu)成，分子中含有多種官能團(tuán)，能使水中膠體懸浮物相互凝聚、沉淀。在傳統(tǒng)的絮凝劑中，無機(jī)絮凝劑投加量大，效果不佳，還會把大量金屬離子帶入最終產(chǎn)物中，對環(huán)境造成危害；有機(jī)合成高分子絮凝劑生物難降解，殘留單體有毒，會對環(huán)境造成二次污染。而微生物絮凝劑最突出的特點(diǎn)是具有生物降解性，而且高效、無毒、易降解、無二次污染且用途廣泛，是環(huán)境友好型絮凝劑，因而引起世界各國學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究

中試階段/n成果簡介：目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)減肥增效、節(jié)能降耗、減少環(huán)境污染是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。聚γ-谷氨酸（簡稱“γ-PGA”）作為一種綠色生物大分子材料，不僅可使作物增產(chǎn)10-30％，節(jié)肥10-20％，還可提高作物品質(zhì)和作物抗病耐旱能力。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室率先在國際上開展了γ-PGA在農(nóng)作物栽培中的應(yīng)用，已申請γ-PGA發(fā)酵及γ-PGA在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用等5項(xiàng)中國發(fā)明專利，其中獲得3項(xiàng)發(fā)明專利授權(quán)。三項(xiàng)相關(guān)課題鑒定成果分別于2007年，2008年，2009年通過湖北省科技廳組織的專家鑒定

微生物合成的γ-聚谷氨酸為均聚氨基酸化合物，分子量在100－1000kDa之間，相當(dāng)于500－5000個左右的谷氨酸單體，具有優(yōu)良的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結(jié)性和極其強(qiáng)的吸水性，從而在高分子材料工程中具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保溫、緩釋、助溶、粘結(jié)和強(qiáng)吸水等功能。作為一種生物材料，γ-PGA又具有生物可降解性好、可食、對人體和環(huán)境無毒害等優(yōu)點(diǎn)，因而在食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和水處理等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。南開大學(xué)專利技術(shù)：一種提高水溶性高聚物發(fā)酵產(chǎn)率的方法（公開號： CN1

成果簡介： 肥料工業(yè)的發(fā)展對保障糧食安全具有重要作用，而化肥的超量使用引起了土壤板結(jié)、農(nóng)產(chǎn)品污染等系列問題，因此開發(fā)高效、生態(tài)的肥料已成為必然趨勢。與現(xiàn)有肥料增效措施相比，聚谷氨酸是生物技術(shù)制備的，具有高效、生物可降解和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，是新一代的高效肥料增效劑。 本團(tuán)隊(duì)針對目前肥料增效劑使用

本成果從一株高產(chǎn) L-異亮氨酸的 C. glutamicum 出發(fā)，運(yùn)用反向代謝工程策略對其代謝通路進(jìn)行理性重排，以期實(shí)現(xiàn) L-蘇氨酸高產(chǎn)，特別是近期，通過熱誘導(dǎo)丙酮酸羧化酶和蘇氨酸外排泵創(chuàng)蘇氨酸產(chǎn)率紀(jì)錄，開發(fā)了一種兩段式溫控發(fā)酵蘇氨酸的重組大腸桿菌和工藝，發(fā)酵罐蘇氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá) 103.28%。這套復(fù) 雜中心代謝途徑的自我調(diào)控維持了生產(chǎn)和生長的平衡。論文用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的一株產(chǎn)蘇氨酸的重組大腸桿菌 TWF001 為宿主，首先編輯了涉及副產(chǎn)物有機(jī)酸合成、產(chǎn)物降解和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，并證實(shí)這一系列菌種在 37 度升至 42 度情況下的生長情況等同正常 37 度發(fā)酵；然后用一套大腸桿菌熱敏啟動子去轉(zhuǎn)錄四環(huán)素啟動子阻遏蛋白，四環(huán)素啟動子后的報告基因 37 度表達(dá)，42 度不表達(dá)。