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角膜（Cornea）作為眼部的重要組織之一，不僅承擔(dān)著屈光、維持眼部正常結(jié)構(gòu)的功能，對外界的病原體及塵埃顆粒也起到阻擋作用。然而，角膜同時(shí)也容易受到諸如細(xì)菌或病毒導(dǎo)致的眼部感染、化學(xué)或機(jī)械性損傷，以及腫瘤和自身免疫性疾病等影響。因角膜而引起的失明已成為全球第四大致盲原因，主要治療方法就是角膜移植。當(dāng)今全球單側(cè)角膜失明人數(shù)約2300萬，雙側(cè)角膜失明人數(shù)約490萬，但每年角膜供體供應(yīng)量只有約10萬。此外，如果受體患者出現(xiàn)角膜血管化或先前排斥史,移植失敗率可高達(dá)70%。因此，尋找臨床上可大量獲得并且具有良好的生物相容性人工角膜，是當(dāng)前亟待解決的問題。? 郭瓊玉與約翰·霍普金斯大學(xué)助理教授Anirudha Singh，美國工程院、醫(yī)學(xué)院兩院院士Jennifer H. Elisseeff合作，在國際上率先提出并實(shí)現(xiàn)了蛋白多糖類似物對膠原蛋白納米纖維結(jié)構(gòu)的有效調(diào)控（圖2）。 據(jù)悉，角膜膠原纖維的直徑大小與排列方式對角膜材料的透光率和機(jī)械性能起著決定性的作用。該研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)糊精類環(huán)狀低聚糖能夠調(diào)節(jié)膠原纖維的玻璃化、排列和超微結(jié)構(gòu)，尤其是β－環(huán)糊精添加到I型膠原蛋白中后產(chǎn)生了與供體角膜相似的纖維層狀結(jié)構(gòu)，從而得以獲得一種具有優(yōu)越透明性和機(jī)械韌性的人工角膜植入物，并且在體外和兔角膜部分切除術(shù)模型上驗(yàn)證了該仿生人工角膜的生物相容性和手術(shù)性能。這項(xiàng)工作為體外制備具有臨床轉(zhuǎn)化前景的仿生人工角膜研究奠定了基礎(chǔ)。

三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成支架材料的微環(huán)境，關(guān)系到產(chǎn)品體內(nèi) 移植后的命運(yùn)與轉(zhuǎn)歸。脫細(xì)胞組織支架材料很好地保留了組織原有的 三維結(jié)構(gòu)，能滿足正常組織的生理需求，是構(gòu)建工程組織和器官的更 適宜載體。本技術(shù)成果以“脫細(xì)胞角膜基質(zhì)”為基礎(chǔ)，擁有一整套自 主知識產(chǎn)權(quán)，已獲得6項(xiàng)國家發(fā)明專利授權(quán)和3項(xiàng)PCT優(yōu)先權(quán)，申請美 國和歐盟專利各1項(xiàng)，3項(xiàng)國內(nèi)發(fā)明專利正在進(jìn)行實(shí)質(zhì)審查；按照企業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)（YZB/粵0120-2009）制備的樣品已經(jīng)通過中國藥品與生物制品 檢定所檢測(檢測報(bào)告編號QZ201006553和QZ201101046)，獲得SFDA 的臨床試驗(yàn)許可。去細(xì)胞異種角膜基質(zhì)經(jīng)中山大學(xué)中山眼科中心倫理 委員會批準(zhǔn)（中山眼科中心倫理審查批件編號2011KYNL001），已開 展臨床試驗(yàn)。

眼角膜作為視覺成像系統(tǒng)中一個(gè)至關(guān)重要的組織，是眼睛最前面的凸形高度透明物質(zhì)，可以保護(hù)眼內(nèi)的微結(jié)構(gòu)及組織，并為眼睛提供大部分屈光力。但是角膜損傷、感染及一些先天性因素導(dǎo)致角膜疾病成為全球第二大致盲疾病。同種異體角膜、人工角膜及人的羊膜移植是三類臨床上應(yīng)用最廣泛的角膜疾病治療方法，但是這些方法都會存在一定的問題或缺陷。因此，利用先進(jìn)的生物制造工程的方法（Biofabrication）開發(fā)出一種治療性的角膜支架，用于替代受疾病影響的角膜組織或誘導(dǎo)角膜組織自身再生，是至關(guān)重要的。目前，角膜組織誘導(dǎo)再生的難點(diǎn)在于角膜基質(zhì)層，該層組織是角膜的主要組成部分，具有多層正交定向的納米纖維板層組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，利用傳統(tǒng)的生物工程的方法很難真實(shí)地模擬基質(zhì)層的結(jié)構(gòu)。纖維板層之間分布著角膜基質(zhì)細(xì)胞，這種細(xì)胞在體外培養(yǎng)及角膜組織損傷時(shí)很容易轉(zhuǎn)化為角膜成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致角膜出現(xiàn)瘢痕。因此，制備能夠模擬天然角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的支架，同時(shí)保持角膜基質(zhì)細(xì)胞的表型，誘導(dǎo)角膜基質(zhì)的再生，是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。針對這一難題，彌勝利和孫偉課題組提出了使用近場靜電紡絲技術(shù)制備網(wǎng)格狀的亞微米纖維支架，并和水凝膠技術(shù)結(jié)合，制備了纖維水凝膠復(fù)合支架，用于模擬正交定向的角膜基質(zhì)板層結(jié)構(gòu)和板層之間起連接作用的糖蛋白。課題組提出了一種最優(yōu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及化學(xué)因子的組合，可以抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞的成纖維分化，保持其表型，并最終實(shí)現(xiàn)角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)再生。圖1：（a）近場靜電紡絲技術(shù)制備的具有不同纖維間距的PECL網(wǎng)格狀亞微米纖維支架在不同放大倍數(shù)下的SEM圖片；（b）接種在100um網(wǎng)格狀纖維支架上的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架及細(xì)胞核染色，細(xì)胞可以在支架上沿著纖維方向生長；（c）5% GelMA水凝膠內(nèi)封裝的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行活死染色圖片；（d）5% GelMA水凝膠內(nèi)封裝的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架及細(xì)胞核染色圖片；（e）纖維水凝膠復(fù)合支架的SEM圖片。目前近場靜電紡絲技術(shù)應(yīng)用最廣泛的材料是PCL，但是由于PCL是疏水材料，不利于細(xì)胞的粘附，因此該研究利用PEG作為引發(fā)劑，合成了PEG和PCL的共聚物PECL，顯著提高了PCL的親水性。課題組首次利用近場靜電紡絲技術(shù)成功制備了正交定向的PECL亞微米纖維支架 (圖1a)，角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞可以在支架表面黏附并沿著纖維方向鋪展及生長 (圖1b)。研究通過將MA修飾到明膠大分子鏈上合成了GelMA，探究出最優(yōu)的MA修飾度及GelMA濃度，可以使封裝在GelMA水凝膠內(nèi)的角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞保持高的細(xì)胞活性(圖1c)并能鋪展開(圖1d)。課題組采用模具灌注的方式制備了纖維水凝膠復(fù)合支架 (圖1e)，通過研究不同纖維間距的網(wǎng)格狀支架對纖維水凝膠復(fù)合支架理化性能的影響，找出了最優(yōu)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以使纖維水凝膠在力學(xué)性能、透光度和溶脹性方面最接近于天然的角膜組織。研究將角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞接種在2D的細(xì)胞培養(yǎng)皿、3D的GelMA水凝膠及最優(yōu)的纖維水凝膠復(fù)合支架內(nèi)，并研究角膜緣基質(zhì)干細(xì)胞在含血清及不含血清的培養(yǎng)基中的分化及角膜基質(zhì)細(xì)胞表型的維持。研究表明，這種最優(yōu)的纖維水凝膠的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及無血清培養(yǎng)基可以抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化。圖2 大鼠角膜基質(zhì)內(nèi)板層移植實(shí)驗(yàn)及評估：（a）5種支架移植后裂隙燈觀察圖片；（b）支架移植后OCT觀察圖片，標(biāo)尺是1000um；（c）術(shù)后不同時(shí)間段中央角膜的厚度；（d）術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月免疫熒光染色圖片觀察組織誘導(dǎo)再生情況，標(biāo)尺是100um；（e）術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月HE染色圖片觀察組織誘導(dǎo)再生情況，標(biāo)尺是100um。最后，研究使用大鼠進(jìn)行角膜內(nèi)的板層移植實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行了3D GelMA水凝膠、含化學(xué)因子3D GelMA、最優(yōu)纖維水凝膠支架及含化學(xué)因子最優(yōu)纖維水凝膠支架的移植，對照組為自體角膜移植（圖2a）。術(shù)后通過OCT、免疫熒光染色及HE染色進(jìn)行3個(gè)月的研究觀察（圖2b-e）發(fā)現(xiàn)相比于其他的支架，含化學(xué)因子的最優(yōu)纖維水凝膠支架的移植可以最好地實(shí)現(xiàn)角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)再生。?論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-14887-9

全球近視病發(fā)病率逐年增加,到2050年全球人口近一半的人口將患近視病。角膜塑形鏡是-種非創(chuàng)傷性的近視治療技術(shù)，在全世界得到廣泛應(yīng)用。僅在中國每年就有超過100萬病人接受角膜塑形鏡治療。在角膜望形鏡配鏡過程中,由于參數(shù)組合眾多,傳統(tǒng)辦法依賴于醫(yī)生經(jīng)驗(yàn),因此配鏡質(zhì)量難以控制、效率不高、費(fèi)時(shí)耗力。本成果是全球首個(gè)基于人工智能算法的角膜塑形配鏡解決方案,實(shí)現(xiàn)了擁有完整自主知識產(chǎn)權(quán)的算法和芯片,比傳統(tǒng)方法提高效率10倍以上，同時(shí)極大保證了配鏡提高質(zhì)量。本成果與“愛爾眼科集團(tuán)”聯(lián)合開發(fā),臨床測試的配鏡準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。

全世界有超過1000萬人的眼盲是由角膜病引起，我國大約有500萬角膜疾病患者，其中400萬可以通過同種異體角膜移植手術(shù)重見光明，但每年能進(jìn)行此項(xiàng)手術(shù)的患者僅為3000例，人角膜供體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求——新型的角膜替代物。 市場上銷售的AlphaCor人工角膜每個(gè)7000美金，本課題活性復(fù)合角膜替代物的成本為120美金/個(gè)，比AlphaCor便宜近60倍。我們開發(fā)的角膜替代物研制方法簡單易行，容易推廣和產(chǎn)業(yè)化，經(jīng)濟(jì)效益顯著。

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