一種基因工程紅球菌及其構(gòu)建方法與應用
1. 痛點問題
紅球菌是具有高抗逆性(耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿)的特殊放線菌,日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產(chǎn)丙烯酰胺——其聚合產(chǎn)物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領(lǐng)域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域最成功的案例之一。開發(fā)紅球菌基因編輯方法,一方面可以實現(xiàn)紅球菌細胞自身性能的按需調(diào)控(如敲除副產(chǎn)物基因),解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細化學品生產(chǎn)中的高成本和高排放問題,另一方面有望以紅球菌細胞為普適性宿主,高表達各種外源功能酶,從而實現(xiàn)重組紅球菌全細胞催化技術(shù)的普遍應用,尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長、工藝復雜、原子經(jīng)濟性差、環(huán)境污染嚴重等各種主要問題。但是,作為一種革蘭氏陽性放線菌,紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉(zhuǎn)化率低、非法重組嚴重等問題,基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質(zhì)粒介導的同源重組,但自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率和單交換成功率很低,正確編輯率更低。因此,迫切需要開發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。
2. 解決方案
本技術(shù)核心成果是一種基于CRISPR(成簇規(guī)律間隔短回文序列)-Cas9(DNA剪切蛋白)技術(shù)的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術(shù)通過紅色紅球菌特有啟動子及質(zhì)粒元件,首先實現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達及切割功能;其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng),將紅色紅球菌基因轉(zhuǎn)化效率提高了80多倍;接下來,又通過紅球菌重組酶的引入,顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率,最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),不僅可以實現(xiàn)基因組上目標基因的敲除、替換和改造,也可實現(xiàn)多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除,為紅球菌全細胞催化平臺技術(shù)開發(fā)及其在化學品綠色先進制造中的應用奠定了堅實基礎(chǔ)。
合作需求
開展合作開發(fā)、技術(shù)許可等,尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應用領(lǐng)域進行紅球菌全細胞催化法生產(chǎn)目標產(chǎn)品的企業(yè)合作,尤其是在上述不同領(lǐng)域具有生產(chǎn)和銷售優(yōu)勢或經(jīng)驗的企業(yè)。
清華大學
2021-12-16