一種多種病原微生物及耐藥基因的多重熒光PCR試劑盒包括用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針、PCR反應預混液、陽質控品、陰性質控品。利用多個熒光通道分別標記對應檢測靶標,通過監控不同熒光通道內熒光信號的變化情況,對不同靶標的擴增情況進行監測,實現對96種病原微生物及耐藥基因的檢測。本發明多重熒光PCR試劑盒可同時檢測多種病原微生物及耐藥基因,并且準確性高、特異性強、靈敏度高、快速且結果可靠。