技術領域：本發明涉及納米泡及其應用，具體涉及一種多肽納米泡及其制備方法和應用。
背景技術：隨著人們生活水平的提高，肥胖人群逐年增加。世界衛生組織報道，作為一種慢性代謝性疾病，肥胖已成為全世界引起死亡的五大風險之一，其原因是由于肥胖可引發多種代謝性疾病，如：2型糖尿病、心腦血管疾病及腫瘤等。因此，針對肥胖的干預治療是預防和治療肥胖相關疾病的重要措施。至今，對于肥胖的治療主要有飲食行為療法、外科手術和藥物治療。對于飲食行為療法來講，當停止減肥后，體重會嚴重反彈，甚至超過了減肥前的體重。而外科手術（如：縮胃術、胃旁路手術、胃束帶手術）的風險又太大。所以許多肥胖患者把藥物治療作為首選。目前，美國FDA批準的兩種減肥藥，分別為西布曲明（Sibutramine）和奧利司他（Orlistat）。但長期使用后存在較大副作用，比如前者可引發高血壓、失眠等，后者會造成腹瀉、排泄失禁等。因此，在參與代謝綜合征相關的器官中，如何使得藥物能夠僅僅作用于脂肪組織，卻對其他臟器和組織不造成影響，從而達到不改變人體免疫系統的基礎上能更高效治療代謝綜合征的目的，成為現在肥胖治療面臨的重要問題和研究重點。
2004年，發表在“Nature Medcine”上的一篇報道發現一種多肽能特異性的與白色脂肪組織血管的內皮細胞受體結合，其氨基酸序列為CKGGRAKDC。中國專利2010101599163公開了一種棕色脂肪組織靶向性多肽及其應用，公開了經修飾的多肽可以與具有生物藥理活性的物質相連接，能夠靶向運送藥物到達棕色脂肪組織，發揮藥理學效應，從而達到靶向治療疾病的目的，側重于報道一種棕色脂肪組織靶向性治療的多肽載體，但該靶向性多肽載體的載藥量及所載藥物的種類及治療肥胖的療效還有待進一步討論。為開發具有靶向性治療代謝疾?。ū热鐞盒阅[瘤）的納米泡藥物，有研究者采用人工合成的外源性多肽修飾細胞微泡，但該方法獲得的外源性多肽修飾的微泡，其生物兼容性問題有待解決。
發明內容
發明目的：為了解決現有的治療肥胖的藥物靶向性不強且穩定性、生物兼容性差的問題，本發明第一方面提供了一種多肽納米泡的制備方法，本發明第二方面提供了所述制備方法制備得到的多肽納米泡，本發明第三方面提供了多肽納米泡的應用，通過包裹藥物（如：核酸類、蛋白類、脂類、糖類、酮類等藥物）和不同給藥方式（如：靜脈注射、皮下或腹腔注射等）靶向治療肥胖。
技術方案：本發明第一方面提供一種多肽納米泡的制備方法，包括以下步驟：（1）構建重組質粒，所述重組質粒包括Flag標簽、脂肪組織靶向性多肽和微泡標志性膜蛋白CD63的編碼基因，Flag標簽和脂肪組織靶向性多肽的編碼基因按順序依次連接在微泡標志性膜蛋白CD63編碼基因的起始密碼子后；其中所述脂肪組織靶向性多肽的氨基酸序列為CKGGRAKDC；（2）將步驟（1）得到的重組質粒通過脂質體轉染到分泌納米泡的細胞中培養收集細胞培養液，經超速離心提取多肽納米泡。步驟（1）中，所述重組質粒的構建步驟如下：以CD63的cDNA為模板，以CD63-F/CD63-R為引物，經PCR擴增得到Flag-peptide-CD63片段，將Flag-peptide-CD63片段插入出發質粒pIRES2-EGFP的XhoI、EcoRI酶切位點之間得到重組質粒；其中引物CD63-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物CD63-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；其中Flag-peptide-CD63片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。其中CD63的cDNA 的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，包括上游5’非編碼序列+CDS +下游3’非編碼序列，CDS的核苷酸序列SEQ ID NO:5所示。更優選地，以pOTB7- CD63為模板。其中，CD63-F中含有XhoI酶切位點（CTCGAG）、Flag標簽序列（GATTACAAGGATGACGACGATAAG）以及脂肪組織靶向性多肽CKGGRAKDC序列（TGTAAGGGAGGAAGAGCGAAGGATTGT）；CD63-R中含有EcoRI酶切位點（GAATTC）。其中，脂肪組織靶向性多肽的氨基酸序列中各個字母符號所代表的氨基酸殘基的定義如下：C為半胱氨酸，K為賴氨酸，G為甘氨酸，R為精氨酸，A為丙氨酸，D為天冬氨酸。步驟（2）中，所述分泌納米泡的細胞可為未成熟的樹狀細胞、間充質干細胞及其他細胞（如293T細胞），在此以293T細胞為例說明。重組質粒按照lipofectamine®3000轉染試劑（貨號：L3000015）說明書導入293T細胞；所述超速離心的步驟如下：細胞培養液經500-1000 g，2-4 ℃，離心10-30 min后取第一次上清，去除細胞沉淀；第一次上清經1500-3000 g，2-4℃，離心20-30 min后取第二次上清，去除一些細胞碎片或殘存的細胞器沉淀；第二次上清經2-4℃，100,000-160,000 g，離心1-2 h后得到沉淀，即為多肽納米泡。本發明第二方面提供所述制備方法制備得到的多肽納米泡，所述納米泡為經脂肪組織靶向性多肽修飾的多肽納米泡。本發明第三方面提供所述的多肽納米泡作為藥物載體在制備治療肥胖藥物中的應用。優選地，所述多肽納米泡包裹攜帶治療肥胖藥物，所述治療肥胖藥物為核酸類藥物、蛋白類藥物、脂類藥物、糖類藥物或酮類藥物。根據攜載藥物的不同，運用不同方法制備獲得多肽納米泡-藥物制劑。更優選地，所述酮類藥物為姜黃素。將姜黃素和多肽納米泡混合，室溫培養，隨后將混合物經蔗糖密度梯度（蔗糖濃度分別為10 wt.%、20 wt.%、30 wt.%、40 wt.%、50 wt.%、60 wt.%、70 wt.%），200,000 g離心1.5-3 h，收集在40-60 %蔗糖濃度中間的黃色條帶，PBS重懸，即為多肽納米泡-姜黃素制劑，姜黃素是包裹在多肽納米泡內部的，從而提高姜黃素的穩定性及降低其毒性。
有益效果：（1）本發明提出了一種新的多肽納米泡，該多肽納米泡為抗肥胖的藥物靶向治療提供了極大的便利，其具有高效、低毒的優勢，所載藥物經多肽納米泡的包裹，使得藥物高效的進入靶細胞，大大提高了藥物的利用率，從而顯著增強了藥物的靶向抗肥胖活性，適用于不同給藥方法如靜脈注射的靶向作用、腹腔、肌肉和皮下注射的緩控釋作用。（2）本專利的制備方法過程簡單，且未破壞藥物本身的性質；制備的多肽納米泡性質穩定，因制備方法是使用分子克隆、細胞轉染的方法將靶向多肽連接到納米泡膜蛋白上的，這種修飾方法獲得的多肽納米泡結構及性質都非常穩定，不會因外界環境的改變而出現脫靶或降解，和人工合成的多肽化學修飾納米泡相比，該制備方法優勢顯著，便于長期保存。