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已有樣品/n本發(fā)明涉及蛋白-蛋白及RNA-蛋白質(zhì)相互作用成像領(lǐng)域，基于激發(fā)波長在600nm以上的紅色熒光蛋白mNeptune熒光片段互補(bǔ)技術(shù)，建立了位于活體成像“光學(xué)窗口”的雙分子和三分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)。其中雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)可以用于活細(xì)胞及活體內(nèi)蛋白-蛋白相互作用成像，三分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)可以用于活細(xì)胞及活體內(nèi)RNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用成像。該成果為首次建立活體內(nèi)RNA-蛋白質(zhì)相互作用熒光成像技術(shù)，該技術(shù)也將有助于開發(fā)活細(xì)胞及活體內(nèi)藥物評價體系和藥物篩選平臺。

開發(fā)了一個高效的捕獲RNA結(jié)合蛋白雙鏈RNA底物的建庫測序技術(shù)（irCLASH）以及后續(xù)的一整套生物信息學(xué)分析方法；首次在轉(zhuǎn)錄組水平上系統(tǒng)地繪制了人類ADAR蛋白的內(nèi)源雙鏈RNA底物圖譜；揭示了決定ADAR結(jié)合效率和編輯效率的底物特征和ADAR結(jié)合長雙鏈RNA的體內(nèi)模型。       該研究利用irCLASH技術(shù)系統(tǒng)構(gòu)建和分析了人類ADAR1、ADAR2及ADAR3的雙鏈RNA底物圖譜，發(fā)現(xiàn)與之前根據(jù)計(jì)算推導(dǎo)的研究設(shè)想不同，ADAR具有大量的、長距離的雙鏈RNA底物。該研究發(fā)現(xiàn)不完全互補(bǔ)配對的底物與ADAR蛋白也有很好的親和度，特別是ADAR2家族成員。研究還進(jìn)一步揭示了決定ADAR結(jié)合效率和編輯效率的底物特征。irCLASH測序技術(shù)及后續(xù)的整套生物信息學(xué)分析方法的開發(fā)為研究雙鏈RNA結(jié)合蛋白的內(nèi)源底物提供了新的工具。同時，該研究揭示的ADAR與底物相互作用及催化特性為研究人員開發(fā)高效的RNA編輯工具提供了資源寶庫及改進(jìn)方向。

環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）circMYBL2通過招募RNA結(jié)合蛋白PTBP1調(diào)控癌基因FLT3 mRNA的翻譯效率，從而促進(jìn)了FLT3-ITD突變型白血的發(fā)生發(fā)展。該項(xiàng)研究成果首次報道新型非編碼RNA circRNA以RNA-蛋白復(fù)合體形式發(fā)揮對翻譯進(jìn)程的正調(diào)控作用，揭示了環(huán)狀RNA的新功能。  FLT3-ITD是在FLT3基因中間的一段串聯(lián)重復(fù)序列突變，該突變可導(dǎo)致Y591等位點(diǎn)的自磷酸化，進(jìn)而激發(fā)下游通路的過度激活，促進(jìn)疾病進(jìn)程。目前普遍認(rèn)為FLT3-ITD突變型白血病預(yù)后極差且容易復(fù)發(fā)，因此，尋找新的 FLT3-ITD 白血病的藥物靶點(diǎn)具有重要意義。該團(tuán)隊(duì)以FLT3-ITD突變型白血病為研究模型，深入研究circRNA潛在作用機(jī)制及其對該類白血病疾病進(jìn)程的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA circMYBL2在FLT3-ITD陽性白血病中高表達(dá)并特異性影響FLT3-ITD陽性白血病細(xì)胞的增殖、凋亡等一系列細(xì)胞功能，卻對FLT3-ITD陰性白血病細(xì)胞無顯著影響。 進(jìn)一步研究顯示，circMYBL2調(diào)控該疾病關(guān)鍵癌基因FLT3的蛋白翻譯過程；揭示了circMYBL2與RNA結(jié)合蛋白PTBP1形成復(fù)合體促進(jìn)了FLT3蛋白的翻譯效率（如上圖）。該工作報道了circRNA調(diào)控翻譯的新功能。

利用A-to-I RNA編輯作為miRNA反義鏈表達(dá)的有利證據(jù)。通過靶向RNA測序技術(shù)，宋玉龍和李麗詩等利用A-to-I RNA編輯推導(dǎo)鏈表達(dá)的方向，揭示了miRNA基因座反義RNA的廣泛表達(dá)和編輯現(xiàn)象。宋玉龍和李麗詩等發(fā)現(xiàn)miRNA和其反義RNA形成了一個相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)：miRNA可以下調(diào)其反義RNA的表達(dá)水平；反義RNA在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控miRNA的表達(dá)和加工。此外，A-to-I RNA編輯可以穩(wěn)定反義RNA的結(jié)構(gòu)，避免其被配對的miRNA所降解。這一研究揭示了前人所未知的miRNA反義鏈編輯現(xiàn)象的廣泛性，為RNA編輯的研究開辟了新的研究方向。

   FTO對人體發(fā)育至關(guān)重要，F(xiàn)TO酶活功能的紊亂會影響發(fā)育和多種疾病的發(fā)生，包括肥胖和癌癥等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）作為mRNA上含量最為豐富的甲基化修飾，是首個被報道的FTO去甲基酶活生理底物。之后陸續(xù)報道FTO生理底物還包括mRNA上5’帽端后的N6，2'-O-二甲基化腺嘌呤（cap m6Am），snRNA的m6A和m6Am，tRNA的N1-甲基腺嘌呤（m1A），除此之外還有體外活性底物單鏈DNA上的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA）和N3-甲基胸腺嘧啶（3mT）與單鏈RNA上的N3-甲基尿嘧啶（m3U）。FTO如何識別眾多的核酸修飾堿基，是否有催化選擇性，如何結(jié)合多種RNA，F(xiàn)TO為什么對cap m6Am的活性高于單鏈RNA上的m6A，及FTO為什么對單鏈RNA或DNA上的m1A沒有活性卻對tRNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的m1A有活性？回答這些FTO的酶催化分子機(jī)制有待于蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析。然而FTO蛋白與核酸底物結(jié)合力太弱，致使獲得FTO蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)一直是該領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和難點(diǎn)。

鑒定了擬南芥中的 m6A 去甲基酶 ALKBH10B ，發(fā)現(xiàn) ALKBH10B 缺失會導(dǎo)致擬南芥顯著的晚花表型， ALKBH10B 通過影響 FT ， SPL3 和 SPL9 的甲基化水平調(diào)控?cái)M南芥的成花誘導(dǎo)。不同的識別蛋白通過對 m6A 的結(jié)合，對 mRNA 的加工代謝產(chǎn)生不同的調(diào)控作用， 進(jìn)而 影響細(xì)胞不同的生理功能。通過開發(fā)甲醛交聯(lián)- 免疫共沉淀(Formaldehyde-crosslinking and immunoprecipitation, FA-CLIP) 技術(shù)，鑒定出全轉(zhuǎn)錄組水平的ECT2-mRNA 相互作用位點(diǎn)，揭示ECT2 主要結(jié)合mRNA 的 3' 非翻譯區(qū)(3'UTR), 并且傾向于結(jié)合保守序列 URUAY (R=G>A, Y=U>A,  其中 UGUAY 序列 占 90% 以上 ) 。使用植物細(xì)胞核裂解液進(jìn)行的體外酶活實(shí)驗(yàn)和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（ EMSA ）證明 UGUA 序列為 植物特有的m6A 保守序列，且UGUm6A 可以被ECT2 高特異性識別。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明ECT2 蛋白分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，結(jié)合高通量測序數(shù)據(jù)分析，推測ECT2 具有雙重功能，ECT2 可能在細(xì)胞核中通過結(jié)合甲基化的UGUA 調(diào)控pre-mRNA 的 3'UTR 加工，在細(xì)胞質(zhì)中ECT2 促進(jìn)mRNA 的穩(wěn)定性。進(jìn)一步機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)影響表皮毛發(fā)育的三個基因ITB1, TTG1 及DIS2 的轉(zhuǎn)錄本可以被m6A 修飾且被ECT2 結(jié)合，在 ECT2 的T-DNA 插入突變體中，ITB1, TTG1 及DIS2 的mRNA 穩(wěn)定性降低，mRNA 表達(dá)量水平降低，繼而導(dǎo)致 ect2 突變體中表皮毛分叉數(shù)增多。

內(nèi)含子是基因中不具有編碼作用的片段，它會被轉(zhuǎn)錄到前體RNA中，但在mRNA加工過程中被剪切掉，而內(nèi)含子剪切是真核生物mRNA成熟的關(guān)鍵步驟。在酵母中，當(dāng)RNA聚合酶II(Pol-II)轉(zhuǎn)錄到內(nèi)含子下游45nt時已經(jīng)有一半的內(nèi)含子完成了剪切。但高等真核生物，尤其植物中RNA共轉(zhuǎn)錄剪切速率，剪切狀態(tài)和其他RNA加工過程之間的關(guān)系又是什么樣的呢？為解答這一疑惑，翟繼先課題組開展了系列研究分析。

蛋白

研究開發(fā)了 “ 熒光團(tuán)輔助的 RNA 鄰近標(biāo)記和測序技術(shù) ” ，簡稱 “CAP-seq” 。   該方法通過可見光激發(fā)遺傳靶向的光敏蛋白 miniSOG 產(chǎn)生活性氧， 介 導(dǎo)鄰近 RNA 分子上的鳥嘌呤與具有生物正交功能把手的氨基探針進(jìn)行共價交聯(lián)，既而通過富集純化與高通量測序檢測，實(shí)現(xiàn) miniSOG 定位的亞細(xì)胞區(qū)域內(nèi) 轉(zhuǎn)錄 組的空間特異性標(biāo)記與鑒定。 利用 CAP-seq ，他們系統(tǒng)研究了幾個亞細(xì)胞區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組，包括線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)錄組 、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面 轉(zhuǎn)錄組 以及 線粒體外膜附近轉(zhuǎn)錄組。這些研究結(jié)果表明 CAP-seq 對 活細(xì)胞中開放區(qū)域的 RNA 標(biāo)記具有良好的空間特異性和覆蓋度 。 他們在線粒體外膜附近檢測到 30 個編碼氧化磷酸化途徑相關(guān)蛋白的 RNA 和多達(dá) 55 個編碼核糖體蛋白的 mRNA ，這一結(jié)果不僅支持了線粒體蛋白在線粒體外膜被翻譯后直接轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)線粒體的模型，還暗示著線粒體功能可能與蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)節(jié)有關(guān)。 CAP-seq 具有操作簡單、空間選擇性高、生物相容性好的特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)適合于在多種生物系統(tǒng)中研究亞細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄組 的新技術(shù)。

真核生物中，mRNA的降解對于mRNA的數(shù)量和質(zhì)量調(diào)控都發(fā)揮關(guān)鍵的作用。成熟的mRNA在細(xì)胞中作為模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，而參與蛋白質(zhì)翻譯的mRNA的數(shù)量受到精確調(diào)控。這一過程不僅取決于基因的轉(zhuǎn)錄水平，也決定于mRNA的降解速率。mRNA 降解主要包括多聚腺苷酸尾（polyA tail）的去除，脫帽（decapping）和核酸酶（ribonuclease）的消化。新近的研究表明，植物細(xì)胞中mRNA也可以在蛋白翻譯進(jìn)行的同時被核酸酶消化，即mRNA逐步退出蛋白翻譯過程與其降解是偶聯(lián)的過程。為保證蛋白翻譯的準(zhǔn)確性，植物細(xì)胞主要通過依賴翻譯的mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制進(jìn)行缺陷mRNA的分選及清除，從而實(shí)現(xiàn)mRNA質(zhì)量的調(diào)控。這些mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制同時也可以作為一種基因表達(dá)調(diào)控方式精細(xì)調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)性。在有缺陷的mRNA不能被核酸酶及時清除時，植物啟動依賴小RNA的轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑（PTGS, posttranscriptional gene silencing）加以剪切使其喪失功能。轉(zhuǎn)錄后基因沉默作為一種防御手段清除過量產(chǎn)生的異常mRNA尤其是外源基因表達(dá)的mRNA，同時mRNA降解途徑確保轉(zhuǎn)錄后基因沉默極少作用于內(nèi)源編碼基因。該綜述對上述過程的分子機(jī)制及其在植物中的生物學(xué)功能進(jìn)行梳理論述，并展望植物領(lǐng)域關(guān)于mRNA動態(tài)降解以及mRNA的數(shù)量和質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制有待研究的問題。