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蛋白酶體是細(xì)胞中用來調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的主要機(jī)制的核心組成部分，是細(xì)胞中最普遍的不可或缺的大型全酶超分子復(fù)合機(jī)器之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白降解機(jī)器。人源蛋白酶體全酶包含至少64個(gè)亞基，由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復(fù)合體組成的調(diào)控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。2016年，該課題組與其合作者在《美國科學(xué)院院刊》報(bào)道了人源蛋白酶體的基態(tài)近原子分辨的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，以及三個(gè)亞納米分辨的RP-CP亞復(fù)合體亞穩(wěn)或過渡態(tài)的共存結(jié)構(gòu)，并首次發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的CP的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道處于開放狀態(tài)（見PNAS 2016, 113: 12991-12996）。這一發(fā)現(xiàn)被德國馬普所Baumeister課題組及其合作者在2017年的一篇《美國科學(xué)院院刊》論文中通過酵母蛋白酶體全酶的冷凍電鏡亞納米精度分析進(jìn)一步證實(shí)、引用和比較（見PNAS 2017, 114, 1305-1310）。然而，在這些工作中，CP開放態(tài)的全酶結(jié)構(gòu)離近原子分辨還有較大距離，未能充分揭示人源蛋白酶體全酶的激活后的運(yùn)動(dòng)行為。毛有東、歐陽頎課題組及其合作者在前期工作的基礎(chǔ)上，利用他們自主開發(fā)的基于統(tǒng)計(jì)流行算法的高性能計(jì)算軟件ROME（見PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法，對ATP-γS結(jié)合狀態(tài)下的人源蛋白酶體的全酶冷凍電鏡單顆粒數(shù)據(jù)展開了深入分析，得到了6個(gè)共存的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，其中包括3.6埃分辨率的基態(tài)結(jié)構(gòu)，3.5埃的開放態(tài)CP結(jié)構(gòu)，和三個(gè)CP開放態(tài)對應(yīng)的亞穩(wěn)簡并態(tài)全酶4.2埃，4.3埃和4.9埃的結(jié)構(gòu)。另外兩個(gè)中間態(tài)結(jié)構(gòu)分辨率為7.0埃和5.8埃。三個(gè)CP開放態(tài)對應(yīng)的全酶結(jié)構(gòu)的主要差別在于位于RP的AAA-ATPase激酶馬達(dá)模塊，伴隨其不同的構(gòu)象變化，至少有四個(gè)ATP-γS分子穩(wěn)定結(jié)合在不同的AAA-ATPase亞基上，為其在不同核酸結(jié)合狀態(tài)下形成的非穩(wěn)定動(dòng)態(tài)構(gòu)象提供了重要證據(jù)。該研究首次觀察到位于AAA-ATPase激酶馬達(dá)模塊中心的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道呈現(xiàn)從螺旋到鞍形不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化，為進(jìn)一步分析底物和蛋白酶體全酶的相互作用奠定了重要基礎(chǔ)。人源蛋白酶體全酶AAA-ATPase馬達(dá)模塊中心的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道發(fā)生大幅度的拓?fù)渥儤?gòu)

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯用于合成多種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)普利藥物，如貝 那普利、西拉普利等，該類藥物用于治療高血壓。在抗高血壓藥物市場中，ACEI與非肽類血 管緊張素II (AngII)受體抑制劑、鈣通道拮抗劑(CCB)形成了三足鼎立的市場格局。該類藥物 2009年的世界銷售為52億美元，國內(nèi)市場約30億元人民幣，國內(nèi)外對普利原料藥需求旺盛，價(jià) 格穩(wěn)定，尤其是貝那普利等緊俏產(chǎn)品，主要依賴進(jìn)口，國內(nèi)外前景樂觀。目前，我國在卡托普 利、依那普利、賴諾普利、雷米普利、喹那普利、貝那普利和福辛普利等8個(gè)普利藥物實(shí)現(xiàn)了 產(chǎn)業(yè)化。傳統(tǒng)的生產(chǎn)(R)-HPBE的方法為化學(xué)法，存在催化劑較昂貴且污染環(huán)境、產(chǎn)物光學(xué)活 性低、對設(shè)備壓力要求高等缺點(diǎn)，本項(xiàng)目采用的生物法，綠色無污染，催化劑成本低，產(chǎn)物光 學(xué)活性高，操作簡單，條件溫和，具有很好的市場前景。 本項(xiàng)目開發(fā)了一種酶促不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備多種普利類藥物關(guān)鍵手性 中間體(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的生物技術(shù)。該技術(shù)易于放大，反應(yīng)溫和(30℃，pH 6.0)，產(chǎn) 品光學(xué)純度高(>99%)，收率85%，且不需要添加昂貴的輔酶再生系統(tǒng)。項(xiàng)目的實(shí)施將節(jié)能減排 20-30%，生產(chǎn)成本降低20%以上，產(chǎn)品收率提高15%，顯示了該項(xiàng)技術(shù)具有很好的工業(yè)應(yīng)用前 景

該專利首次公開了三種偏甘油酯脂肪酶突變體及其制備方法,解決了偏甘油酯脂肪酶在實(shí)際生產(chǎn)及應(yīng)用中所存在熱穩(wěn)定性差的國際性技術(shù)難題。專利技術(shù)在廣東溢多利生物科技股份有限公司實(shí)施生產(chǎn)，開發(fā)形成系列濃縮復(fù)合酶產(chǎn)品，成功用于養(yǎng)殖、食品及造紙等行業(yè)中，成功出口東南亞、南亞、南北美洲、東歐和韓國、中國臺(tái)灣、澳洲等多個(gè)“一帶一路“沿線國家及地區(qū)，并被當(dāng)?shù)赜脩羲毡榻邮芎驼J(rèn)可。截至2017年12月，所開發(fā)的產(chǎn)品累計(jì)為企業(yè)帶來銷售額接近1.8億元，利稅近2700萬元。獲得了中國專利優(yōu)秀獎(jiǎng)和廣東專利金獎(jiǎng)。

一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工1 成果簡介一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細(xì)胞株。這是國內(nèi)第一個(gè)使得 CPC 酰化酶活性能夠達(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過自己開發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。2 技術(shù)指標(biāo)菌 種：基因工程大腸桿菌，卡那抗性，組成型表達(dá)。 發(fā)酵溫度： 37℃ 培 養(yǎng) 基：普通的大腸桿菌培養(yǎng)基，主要成分有玉米漿等廉價(jià)的營養(yǎng)源。 發(fā)酵周期： 20 小時(shí) 發(fā)酵酶活： 3U/ml 以上（ 5 升發(fā)酵罐） 特 點(diǎn)：遺傳特性穩(wěn)定，不需要添加誘導(dǎo)劑和抗生素，工藝簡單。3 合作方式小試技術(shù)轉(zhuǎn)讓或合作進(jìn)行中試。4 所屬行業(yè)領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生。業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細(xì)胞株。這是國內(nèi)第一個(gè)使得 CPC 酰化酶活性能夠達(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過自己開發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。

一步酶法從頭孢菌素c（ CPC） 生產(chǎn)7－氨基頭孢烷酸（7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細(xì)胞株。這是國內(nèi)第一個(gè)使得 CPC 酰化酶活性能夠達(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過自己開發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯用于合成多種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)普利藥物，如貝 那普利、西拉普利等，該類藥物用于治療高血壓。在抗高血壓藥物市場中，ACEI與非肽類血 管緊張素II (AngII)受體抑制劑、鈣通道拮抗劑(CCB)形成了三足鼎立的市場格局。該類藥物 2009年的世界銷售為52億美元，國內(nèi)市場約30億元人民幣，國內(nèi)外對普利原料藥需求旺盛，價(jià) 格穩(wěn)定，尤其是貝那普利等緊俏產(chǎn)品，主要依賴進(jìn)口，國內(nèi)外前景樂觀。目前，我國在卡托普 利、依那普利、賴諾普利、雷米普利、喹那普利、貝那普利和福辛普利等8個(gè)普利藥物實(shí)現(xiàn)了 產(chǎn)業(yè)化。傳統(tǒng)的生產(chǎn)(R)-HPBE的方法為化學(xué)法，存在催化劑較昂貴且污染環(huán)境、產(chǎn)物光學(xué)活 性低、對設(shè)備壓力要求高等缺點(diǎn)，本項(xiàng)目采用的生物法，綠色無污染，催化劑成本低，產(chǎn)物光 學(xué)活性高，操作簡單，條件溫和，具有很好的市場前景。 本項(xiàng)目開發(fā)了一種酶促不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備多種普利類藥物關(guān)鍵手性 中間體(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的生物技術(shù)。該技術(shù)易于放大，反應(yīng)溫和(30℃，pH 6.0)，產(chǎn) 品光學(xué)純度高(>99%)，收率85%，且不需要添加昂貴的輔酶再生系統(tǒng)。項(xiàng)目的實(shí)施將節(jié)能減排 20-30%，生產(chǎn)成本降低20%以上，產(chǎn)品收率提高15%，顯示了該項(xiàng)技術(shù)具有很好的工業(yè)應(yīng)用前 景。

包蟲病是由棘球絳蟲寄生于人體或宿主動(dòng)物而引起的嚴(yán)重寄生蟲疾病。而我國是同時(shí)有囊型和泡狀兩種類型的包蟲病高發(fā)區(qū)。目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗包蟲病藥物是阿苯達(dá)唑，但是該藥的腸道吸收率很差，而且其一般只能抑制寄生蟲生長而不能徹底有效殺滅寄生蟲，導(dǎo)致患者必須長期大量服用該藥物才能達(dá)到治療效果。與此同時(shí)，大量的研究發(fā)現(xiàn)該藥可引起多系統(tǒng)的嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)。因此，尋找或開發(fā)療效顯著且副作用小的包蟲病治療新藥物具有重大的意義。 棘球絳蟲獲取能量的主要方式通過糖酵解過程。而甘油醛 3-

帕金森病是一種是老年人群中常見的慢性、進(jìn)行性、運(yùn)動(dòng)障礙性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病主要是由于大腦中缺乏多巴胺引起的．左旋多巴(Levodopa，L-dopa)為目前治療帕金森病的主要藥物．多巴胺不能夠通過血腦屏障到達(dá)大腦治療帕金森病，而 L-dopa 能夠通過血腦屏障，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在體內(nèi)脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶罚瑥亩委熍两鹕。Ｒ姷闹委熍两鹕〉乃幬锒酁?L-dopa 及其與其他藥物的復(fù)合物，如美多芭、息寧等。在全球 500 強(qiáng)暢銷藥物市場中，抗帕金森治療市場超過 20 億美元。 來源于大腸桿菌的 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶（ p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase ，PHAH) 具有較寬的底物范圍，可以將 L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為 L-dopa，反應(yīng)單向進(jìn)行，產(chǎn)物均為 L 型，且該酶不會(huì)進(jìn)一步氧化 L-dopa。但由于 L-酪氨酸并不是 PHAH 的最適底物，該方法催化生成 L-dopa 反應(yīng)速率慢，到目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高產(chǎn)率為 12.5g/L，并不能實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。 前期本實(shí)驗(yàn)室通過對大腸桿菌芳香族氨基酸代謝途徑進(jìn)行改造，已獲得從葡萄糖發(fā)酵生成 L-酪氨酸高產(chǎn)大腸桿菌菌株，發(fā)酵水平僅次于美國麻省理工學(xué)院與美國杜邦合作文獻(xiàn)報(bào)道的 L-酪氨酸發(fā)酵水平.本課題對 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶進(jìn)行突變改造，獲得了一催化反應(yīng)速度大幅提升的突變體。在 L-酪氨酸的代謝途徑的基礎(chǔ)上，含 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶突變體的大腸桿菌培養(yǎng) 38 小時(shí)轉(zhuǎn)化生成左旋多巴產(chǎn)率即可達(dá) 50g/L 以上，且培養(yǎng)發(fā)酵簡單易行為世界上首個(gè)采用此法可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的左旋多巴生產(chǎn)路線。目前左旋多巴市場價(jià)格約為50 萬/噸，此法生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于左旋多巴市場價(jià)格。

報(bào)道了pre-tRNA結(jié)合人源tRNA剪接內(nèi)切酶 (tRNA splicing endonuclease, TSEN) 復(fù)合物處于“預(yù)催化”和“催化后”兩種狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)，結(jié)合體外生化，揭示了TSEN復(fù)合物識(shí)別和剪切pre-tRNA內(nèi)含子的分子機(jī)理。