在國家自然科學基金和國家重點研發計劃等項目的資助下，江南大學生命科學與健康工程學院史勁松教授課題組在極端嗜熱祖先腈水解酶的挖掘與機制解析方面的研究工作取得重要進展。研究成果以“Designing ASSMD Strategy for Exploring and Engineering Extreme Thermophilic Ancestral Nitrilase for Nitriles Biocatalysis”為題于2024年9月發表在ACS Catalysis雜志上。江南大學2021級博士研究生汪子凱為第一作者，生命科學與健康工程學院龔勁松教授和生物工程學院陸震鳴教授為通訊作者。
酶的熱穩定性對于延長反應時間和可重復使用性至關重要。極端酶以其高熱穩定性而聞名，在生物催化領域被廣泛關注。極端酶在極端條件下進化，可能在適應當前環境的進化過程中已經滅絕。幸運的是，祖先酶序列重構可以通過計算機算法推演出現有酶的祖先酶序列。該研究旨在開發ASSMD工作流，探究腈水解酶進化景觀，挖掘極端嗜熱祖先腈水解酶并解析祖先酶熱穩定性與催化特性機制。
（1）本研究為了揭示進化景觀的分子水平信息，設計了一個構建祖先酶序列-結構-動力學參數庫的工作流，稱為ASSMD策略。
（2）該策略被用于挖掘極端嗜熱祖先腈水解酶的研究中。腈水解酶可以催化腈類化合物水解成羧酸，被廣泛應用于制藥、食品和化工等各個領域。首先，使用系統發育樹展開腈水解酶的進化歷史，以創建祖先酶序列庫，其中包括69個代表樹根和分支的祖先酶序列。研究發現，基于ASSMD策略，腈水解酶進化景觀中存在一個動力學柔性洼地（該區域的祖先腈水解酶的RMSD值明顯低于其他區域），包括七種祖先酶。
（3）進一步對這些祖先酶進行實驗表征，發現了一種極端嗜熱的祖先酶ASR135，能夠耐受高達90℃的高溫。基于半衰期、變性溫度以及最適反應溫度推測，ASR135可能來源于已經滅絕的極端物種。
（4）為了更深入地了解其進化信息，通過結合能量計算和實驗室進化，對其進化事件進行了進一步分析。基于實驗室人工進化進一步增強了ASR135的熱穩定性，獲得了一種突變體ASR135-M4，即使在沸水溫度（100℃）下也能表現出水解活性。
（5）進一步研究表明，ASR135-M4在經過實驗室進化以提高其熱穩定性后，在其結構中表現出額外的鹽橋、氫鍵、π-烷基相互作用四面體籠和增強的疏水核心，表現出魯棒性強的相互作用網絡。
（6）為充分挖掘本研究中所探究的祖先酶的應用潛力，探究了祖先腈水解酶的底物譜，發現該祖先酶具有明顯的芳香腈類的底物偏好性。最后對這種腈水解酶的芳香腈底物偏好性進行了機制解析，成功發現了一種活性中心CYS與底物的“指向/背向”機制。這種機制展示了芳香/脂肪腈被親核進攻的概率差異，從而導致腈水解酶對兩種底物的底物偏好性差異。總的來說，該研究證明了ASSMD策略在發現更多具有極端嗜熱性的祖先腈水解酶資源以獲得各種工業應用的耐熱酶方面的潛力。
該研究成功通過祖先序列挖掘優化獲得了一個全新的極端腈水解酶，其在沸水條件下的催化活性為腈水解酶在極端條件的生物催化應用開辟了新的可能，其對芳香族腈類底物的高底物特異性催化及定向合成特定羧酸產品提供了新的酶促路，并將加速酶分子改造和定向進化的進程。在此基礎上相關技術體系的拓展可能催生出一批高性能、高穩定性的新型生物催化劑及組合，有望改變傳統化學工業格局。